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实时荧光定量实验常见术语有哪些

发布时间:2021-10-19   点击次数:39次
  实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,对PCR产物进行标记跟踪,随着PCR反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化,并结合相应软件对产物进行分析,可以得到荧光扩增曲线,从而计算待测样品中目的基因初始模版的量,常用于分析目的基因的表达水平的变化。
 
  如何提高实验反应的灵敏度与特异性?
 
  (1)确定模板RNA完整性,无DNA污染。
 
  (2)RNA模板中不应含有扩增反应的抑制剂。
 
  (3)为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。
 
  (4)使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
 
  (5)若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
 
  (6)设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构。
 
  定量分析常见术语:
 
  (1)扩增子:PCR过程而产生的DNA短片段。
 
  (2)扩增曲线:根据荧光信号相对于循环数而制作的曲线。
 
  (3)基线:PCR起始时,荧光信号还未发生变化的几个循环。
 
  (4)Ct(阈值循环):荧光信号超过NTC(无模板对照样品)固定阈值时的循环数 。用于对扩增质量进行验证。
 
  (5)核酸目标:(也称为“目标模板”)--需要扩增的DNA或RNA序列。
 
  (6)惰性参比染料:一种可作为内部对照,以用于在数据分析时对报告基团染料信号进行均一化的染料。均一化是对因浓度或体积变化而随之引起波动进行的必要校正。所有的SDS PCR试剂盒都提供了参比荧光对照。
 
  (7)Rn(均一化报告基团):报告基团染料释放的荧光强度除以惰性参比染料释放的荧光强度。
 
  (8)阈值:早期PCR循环时Rn值的平均标准差,乘以相应的校正系数阈值应当设定在PCR指数扩增时的相关区域。

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