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无缝克隆是一种新型、快速、简洁的克隆方法

发布时间:2021-09-28   点击次数:31次
  无缝克隆是一种新型、快速、简洁的克隆方法,可以同时将多个DNA片段克隆到任何载体中。只需插入的DNA片段末端与载体末端具有15-20个同源碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。
 
  应用:
 
  载体DNA片断克隆,载体DNA片断组装,突变载体构建,基因表达载体构建等。
 
  优点:
 
  (1) 构建的克隆没有任何额外的碱基序列,因此是真正的"无缝克隆";
 
  (2) 可通过一个反应将一个或多个片段快速、定向地插入到载体的任何位置;
 
  (3) 待插入的PCR扩增产物无须酶切;
 
  (4) 插入片段的大小范围宽,从20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入;
 
  (5) 可通过PCR扩增获得线性化载体,因此限制性内切酶消化并不是克隆所必须的;
 
  (6) 酶催化的重组连接反应非常快速和高效,对于一个片段的插入仅需50℃处理15分钟;对于三个片段的插入仅需50℃处理30分钟,而对于5个片段的插入也仅需50℃处理约60分钟;
 
  (7) 只有插入片段和线性化载体的末端才能发生同源重组,可以有效避免非特异性的同源重组;
 
  (8) 阳性克隆比例高,单个DNA片段克隆的阳性率几乎为100%,三个片段的克隆阳性率约为70-80%。
 
  实验流程概览:
 
  (1) 线性化克隆载体制备;
 
  (2) 插入片段扩增引物设计;
 
  (3) 插入片段PCR扩增;
 
  (4) 进行重组反应;
 
  (5) 反应产物转化、涂板;
 
  (6) 克隆鉴定。
 

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