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实时荧光定量具体注意事项有哪些

发布时间:2021-09-26   点击次数:29次
  实时荧光定量就是实时检测PCR每个循环扩增产物相对的荧光信号,来实现对起始模板进行定量及定性的分析。实时荧光定量是通过多扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时监测,并分析指数期的扩增情况来实现对起始模板的定量分析。该技术使用的荧光来源包括荧光探针和荧光染料。前者是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,因此特异性更高;而后者则能结合所有的双链DNA,因此不必因模板的不同而特别定制,通用性强,但需要保证扩增产物的特异性。
 
  原理:
 
  利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,精确的对起始模板的定量分析。
 
  在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质,随着PCR反应的进行,扩增产物不断累积,荧光信号强度不断增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,得到一条荧光扩增曲线图,从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化。
 
  注意事项:
 
  1.在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中,注意避免 mRNA 断裂。
 
  2.为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
 
  3.内参的设定:主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
 
  4.PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
 
  5.防止DNA的污染:采用DNA酶处理RNA样品,在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA 的共线性。
 
  6.所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
 
  7.塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
 
  8.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2室温10min,然后用 0.1%DEPC水冲洗,晾干。
 
  9.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
 
  10.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换,尽量避免其他人员干扰。
 
  11.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
 
  12.DEPC是蛋白质强变性剂,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性,致癌物,因而使用时应在通风橱操作,需戴一次性手套,一次性口罩,小心操作。
 
  13.RT试剂盒从冰箱拿出,应该充分解冻,瞬离后,混匀,放于冰上,可在冰上加样。试剂可以用数字贴纸编号,避免漏加、错加试剂。
 
  14.取用不同的试剂时,必须更换枪头,样本之间要避免交叉污染。
 
  15.逆转录时,PCR仪可以先预热。
 
  16.反应体系配好之后,应充分混匀,瞬离,并且弹去管内的气泡。
 
  17.实验过程中应预防RNA酶污染,使用无酶枪头以及EP管,同时台面可以使用固相RNA酶去除剂清洁。
 
  18.PCR时,管壁尽量避免写字。
 
  19.管盖一定要盖严。
 
  20.10μL逆转录反应体系建议加入不超过500ng的RNA。
 
  21.如果目的基因表达量非常低,至多加入1μg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续PCR的线性范围。
 
  22.反应体积可根据需要等比例放大。
 
  23.试剂尽量不要反复冻融。
 
  24.每个样品至少3个平行孔,所有成分加完后,离心去除气泡。
 
  25.可将所有共同物质加入同一管中,混匀后分散入其他管中。
 

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