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关于实时荧光定量的几个基本概念介绍

发布时间:2021-07-23   点击次数:101次
  实时荧光定量是一种通过在PCR反应体系中引入一种荧光物质,对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测,以此对初始模板进行定量分析的实验。相对定量指的是在待测样本中目的序列相对于另一对照样本的量的变化,比较对两个或多个不同处理的样本中的基因表达水平的高低变化,得到的结果是比率。
 
  实时荧光定量的几个基本概念:
 
  1、扩增曲线
 
  为了更好的理解荧光定量PCR原理,我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线,而是呈S型曲线。
 
  2、荧光阈值
 
  在介绍荧光阈值之前,先了解一下荧光本底信号,我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline,基线期),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍(机器自动设置)。我们在做荧光定量PCR实验时,经常采用手动设置,手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光高值,同时要尽量选择进入指数期的初阶段,真正的信号是荧光信号超过域值。
 
  3、Ct值
 
  了解了荧光阈值的概念后,Ct值就很好理解了。C代表Cycle,t代表threshold,所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中,当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
 
  4、标准曲线
 
  在绝对定量中,未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct值推算出。在实验过程中,我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释(5-6个稀释梯度),将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应,将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线,通过标准曲线可以推算出未知样品的量。标准曲线的制作不需要人工操作,由仪器自动完成。理论上,一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距,如果PCR反应呈理想的方式扩增,产物在每一循环都加倍,荧光曲线之间的间距则符合等式“2n=稀释倍数”,n为2样本间Ct值差。
 
  5、扩增效率
 
  在绝对定量中,我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光PCR实验,利用拷贝数和Ct值做成标准曲线,利用递减的直线关系等式和相关系数(r)或可信度来计算扩增效率。

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