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叮咚~您有一份提高无缝克隆连接效率的『技巧干货』待查收!

发布时间:2021-07-19   点击次数:271次


Gibson Assembly原理


Gibson Assembly原理示意图

In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能够识别3’末端碱基,具有3’→5’外切酶活性的特点。通过In-Fusion酶产生5’黏性末端,互补重叠片段退火配对;再将重组片段转化到感受态细胞内,重组片段序列中的缺刻在菌体内进行连接,获得重组序列。




无缝克隆的优势

  • 不受酶切位点限制

  • 适用于任意载体、任意片段

  • 一步连接1或多个片段,连接多片段耗时短

  • 插入目的片段两端不会添加额外序列(如保护碱基)

无缝克隆实验关键影响因素

片段质量

  • 确保DNA片段无核酸酶及其它酶污染、无乙醇等残留;

  • 纯度正常:A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右、紫外吸收峰图正常;

  • 浓度正常:插入片段与线性化载体浓度高于50 ng/μl,会使重组效率提高;

  • 若模板浓度低、纯度低,则连接效率降低。


载体线性化方法

线性化载体可以选择反向PCR或酶切的方法:

  • 可根据在载体插入位置是否有合适的酶切位点选择具体方法。因Gibson Assembly反应体系内无双链DNA连接酶,不会发生载体自连,线性化载体不需要进行末端去磷酸化处理。酶切制备线性化载体建议使用双酶切,且酶切后采用胶回收的方法回收产物,这样利于降低假阳性。

  • 若没有合适酶切位点或者多次酶切制备线性化载体均不成功,可以选择反向PCR扩增,但不适合较大质粒,如超过8 kb。


引物设计

  • 目的片段引物设计:目的片段引物是由目的片段两端序列加同源臂序列组成,同源臂长度设置在16-45 bp,Tm值在58–65°C。同源臂越长,有利于重组置换,但可能会影响目的片段扩增;

  • 载体引物设计:确定目的片段插入位置,推荐借助Snapgene软件设计反向PCR引物。


PCR扩增

  • 反向PCR制备线性化载体及扩增目的片段时需要使用高保真酶;

  • 制备线性化载体后使用Dpn I内切酶消化环状质粒模板,降低假阳性克隆。


插入片段与线性化载体摩尔比

  • 10 µl 反应体系,载体与插入片段总加入量建议在 0.01-0.3 pmol。插入片段与线性化载体的最佳摩尔比为 1:1-4:1;片段与片段的摩尔比为1:1。

  • 推荐使用GenStar 克隆连接反应体系计算工具,快速计算载体与目的片段使用量。


感受态转化效率

  • 插入片段与载体全长超过10 kb,属于长片段克隆,应使用高效感受态;如:转化效率大于108 cfu/μg DNA的感受态细胞。

  • 感受态细胞与重组质粒用量比例不小于10:1。


只要注意以上几点,高效无缝克隆实验轻松get。


什么?不清楚无缝克隆实验具体怎样操作?

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